半岛平台官网_高效CRISPR-Cas9介导酵母多重基因组编辑

文章背景概述耐高温的汉逊酵母Ogataeapolymorpha是一种具备基础研究和应用于价值的微生物。它已沦为研究甲醇利用、细胞自噬、硝酸同化的最重要有机体。

它的一个更有人的特性是需要通过非同源末端相连（NHEJ）将多达100个目标拷贝基因统合到基因组中。此外，它可以利用人体低聚糖制备糖蛋白，还可以在超过50℃的温度下生长，从而可减少工业烘烤便宜的加热成本。

CRISPER－Cas9辅助基因组编辑技术的研究进展为创建多重基因组工程获取了一种有效地的途径。其基本原理是：反式转录crRNA：crRN双链必要引领Cas9蛋白与目标DNA序列融合，然后Cas9蛋白在PAM上游的三个核苷酸中产生双链断裂（DSB）。

DSB可以通过非同源末端相连放入或修缮，也可以通过同源重组来展开精准编辑，如基因敲除，点变异等。核糖体DNA（rDNA）是编码核糖体RNA的DNA序列。在酵母中，rDNA一般来说由大量的完全相同反复序列构成。在O．polymorpha中，rDNA包括50－60个8kb的反复单元。

在酿酒酵母（S．cerevisiae）中，rDNA位点由150－200个反复序列构成，反复序列为9．1kb。近年来，rDNA反复序列已沦为一些酵母菌多拷贝基因统合的目标位点。2018年6月，中国科学院微生物学研究所病原微生物学与免疫学重点实验室的LaiyouWang等人，在《BiotechnologyforBiofuels》杂志（IF2018＝5．497；工程技术1区）公开发表了为题“EfficientCRISPR－Cas9mediatedmultiplexgenomeeditinginyeasts”的文章。

所用到的主要方法1．活细胞的制取及转化成2．质粒建构和模板编辑3．编辑效率计算出来：编辑效率＝所须要突变体数目／总被测菌落数4．流式细胞仪分析5．基因拷贝数估算6．稳定性检测7．鼓瓶烘烤8．产品浓度分析：HPLC文章主要内容摘要在本研究中，作者发展了一种CRISPR－Cas9辅助多重基因组编辑（CRISPR–Cas9－assistedmultiplexgenomeediting，CMGE）方法，还包括多重基因敲除、多位点（ML）和多拷贝（MC）统合方法。在CMGE的基础上，对汉逊酵母（O．polymorpha）展开了基因敲除、统合和准确点变异等基因组标记。使用CMGE－ML统合方法，在白藜芦醇生物合成途径三个有所不同的位点同时统合橙色滑柱菌（Herpetosiphonaurantiacus）的酪氨酸解氨酶（TAL）基因，拟南芥的4－香豆酰CoA连接酶（4CL）基因和酿酒葡萄的芪通酶（STS）基因，顺利构建白藜芦醇在O．polymorpha内的生物合成。使用CMGE－MC方法，将有所不同拷贝数的融合基因表达盒Psctef1－TAL－Psctpi1－4CL－Psctef2－STS统合到基因组中，白藜芦醇产量比单拷贝统合提升了20倍，超过97．23±4．84mg／L。

此外，本研究还利用CMGE－MC技术分别统合了人血清白蛋白（HSA）和大肠杆菌赖氨酸脱羧酶（cadA）基因，构建了人血清白蛋白和尸胺的生物合成。除汉逊酵母外，本研究还在酿酒酵母内也顺利地创建了CMGE－MC方法。

CMGE方法为O．polymorpha和其他酵母的基因工程和制备生物学研究获取了一个有效地的工具。

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